생물학자는 유전자 발현과 기능을 연구하기 위하여 DNA 기술을 이용한다

 

생물학자는 유전자 발현과 기능을 연구하기 위하여 DNA 기술을 이용한다. (캠벨생명과학, 11판, p407)

생물학적 체계가 어떻게 작동하는지 보기 위해서, 과학자들은 그 체계의 각 성분들이 어떻게 기능하는지를 이해하려고 한다. 단일 또는 그룹 유전자가 언제 그리고 어디에서 발현되는지 분석하는 것은 그 유전자 기능에 대한 중요한 단서를 제공할 수 있다.

유전자 발현 분석하기

다세포 생물의 여러 세포 형태들, 암세포들, 혹은 발생 중인 배아 조직 등을 이해하려고 하는 생물학자들은 우선 그 관심 세포들에 의해 어떤 유전자들이 발현되는지를 알아내려고 한다. 가장 직접적인 방법은 일반적으로 만들어지고 있는 mRNA를 확인하는 것이다. 먼저 특정 개별 유전자의 발현 패턴을 찾는 기술을 살펴볼 것이다. 다음, 관심 있는 세포나 조직에서 발현되는 유전자 그룹의 특성을 규명하는 방법을 탐험할 것이다. 이러한 모든 과정은 상보적 뉴클레오타이드 염기서열 사이에서 염기쌍을 형성하는 방법들에 의존한다는 것을 알게 될 것이다.

단일 유전자 발현 연구하기

초파리(Drosophila melanogaster) 배아 발달에 중요할 것이라고 생각되는 유전자를 클로닝했다고 생각해 보자. 우선 궁금한 것은 어떤 배아 세포들이 그 유전자를 발현하는지, 다시 말해 배아의 어떤 부분에서 해당 mRNA가 발견될지에 관한 것이다. 어떤 방법으로든 우리가 추적할 수 잇는 상보적 서열을 가진 분자를 이용하여 핵산 혼성화를 함으로써 그 mRNA를 추적할 수 있다. RNA이든 DNA이든 상관없지만, 상보적으로 결합하는 그 짧고 단일 가닥인 핵산을 핵산 탐침(nucleic acid probe)이라고 한다. 우리가 분리한 유전자를 주형으로 사용하면 그 mRNA에 상보적인 탐침을 합성할 수 있다. 예를 들면, 만약 mRNA 염기서열 부분이    5’···CUCAUCACCGGC···3’      이라면 우리는     5’···GCCGGTGATGAG···3’   와 같은 단일 가닥의 DNA 탐침을 합성할 수 있을 것이다. 각 탐침 분자는 합성되는 동안 형광으로 표지되고 따라서 추적이 가능해진다. 용액에 들어 있는 탐침 분자는 초파리 배아에 적용되면 배아세포가 전사하는 많은 mRNA에서 상보적인 염기서열과 특이적으로 혼성화된다. 이러한 기술로 우리는 생명체 내의 장소에서 mRNA를 볼 수 있고, 이를 제자리 혼성화(in situ hybridization)라고 한다.

다른 mRNA 탐지 기술은 다른 종류의 세포나 발달 단계가 다른 배아처럼 같은 시점에 여러 시료에서 특정 mRNA의 양을 비교하는 데 용이하다. 널리 사용되고 있는 한 방법은 역전사효소-중합효소연쇄반응(reverse transcriptage-polymerase chain reaction, RT-PCR)이라고 한다.

RT-PCR은 mRNA를 염기서열이 일치하는 이중 가닥 DNA로 전환함으로써 시작된다. 첫째 단계는 역전사효소가 각 mRNA 분자의 역전사체(reverse transcript)인 단일 가닥의 DNA를 만드는데 사용된다. mRNA의 3’ 말단은 폴리-A 꼬리(poly-A-tail)라고 하는 일련의 아데닌() 뉴클레오타이드로 되어 있음을 기억하라. DNA 가닥 합성을 위한 프라이어로써 짧은 상보적 가닥의 타이민 디옥시리보뉴클레오타이드(poly-dT)의 사용이 가능하다. mRNA의 효소분해 후, 첫 번째 DNA가닥과 상보적인 두 번째 DNA 가닥이 DNA 중합효소에 의해서 합성된다. 그 결과로 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA)라고 하는 이중 가닥 DNA가 만들어진다. (mRNA으로부터 만들어진 cDNA는 인트론이 없으므로, 앞서 언급한 대로 세균에서의 단백질 발현에 사용될 수 있다.) 예를 들면, 관심 있는 초파리 유전자의 발현 시점을 분석하기 위하여 여러 단계의 초파리 배아로부터 mRNA 분리 후, 각 단계의 cDNA를 만든다.

RT-PCR의 다음 단계는 PCR 단계이다. 기억하는 것처럼, PCR은 관심 부위의 서로 반대 말단에 혼성화되는 프라이머들을 사용하여 특정 이중 가닥 DNA를 빠르고 많이 복제할 수 있는 방법이다. 각각의 시료에서 PCR 증폭 주형으로 각 배아 단계의 cDNA를 사용하여 초파리 유전자 부위와 일치하는 프라이머들이 첨가된다. 산물이 젤에서 분석될 때, 관심 유전자의 mRNA를 가지고 있는 시료만 증폭 부위의 복제 DNA 밴드를 보여주게 된다. 정량적 RT-PCR(quantitative RT-PCR, qRT-PCR)이라는 향상된 기술은 이중 가닥의 PCR 산물을 측정할 수 있기 때문에 전기영동 필요 없이 정략적 데이터 제공이 가능하다. 서로 다른 조직들로부터 얻은 mRNA를 이용하여 어느 조직이 특정 mRNA를 만드는지를 한 번에 알아내기 위해서는 RT-PCR 또는 qRT-PCR이 사용될 수도 있다.

상호작용하는 유전자들의 발현에 대한 연구

생물학자들의 주요 목표 중 하나는 생명체를 만들어내고 그 기능을 유지하게 하는데 유전자가 어떻게 서로 협동하는지를 알아내는 것이다. 많은 생물종들의 유전체 염기서열이 밝혀진 현시점에서 많은 유전자들의 발현 연구가 가능하다. 그래서 시스템 접근(system approach)이라고 불리고 있음. 과학자는 유전체 DNA를 사용하여 다른 조직이나 다른 발생 단계에서 발현되는 유전자가 어떤 것인지를 조사할 수 있다. 한 가지 목적은 완전한 유전체에서 유전자 발현의 네트워크를 확인하는 것이다. 유전체 수준의 발현 연구는 DNA 마이크로어레이 분석법(DNA microarray assays)을 이용하여 실행할 수 있다. DNA 마이크로어레이는 많은 수의 단일 DNA 가닥들을 아주 소량으로 유리 슬라이드 위에 격자형으로 배열해 단단히 고정시킨 것이다. (이러한 어레이는 컴퓨터칩과 비교하여 DNA칩(DNA chip)이라고 부르기도 한다.) 이상적으로 이러한 조각들은 한 생물체의 모든 유전자들을 대표한다. 연구 중인 세포의 mRNA는 cDNA로 역전사되고, 형광 표지가 추가되어 cDNA가 마이크로어레이의 탐침으로 사용될 수 있다. 여러 개의 샘플을 동일한 실험에서 테스트할 수 있도록 다른 세포 표본에 다른 형광 표지를 사용한다. 그림 19.12의 실제 크기의 마이크로어레이에 나타난 착색된 점의 패턴은 각 탐침이 결합된 점 및 데스트되는 세포 샘플에서 발현되는 유전자를 나타낸다. 마이크로어레이 기술은 1995년에 여러 논문이 출판된 이후 사용되기 시작했다. 그 이후 보다 정교한 응용 프로그램이 개발되어 사용 중이다.

점차적으로 신속하고 저렴한 DNA 염기서열 분석 방법의 출현으로 마이크로어레이 사용이 감소한고 있다. 연구자들은 이제 어떤 유전자가 발현되는지를 발견하기 위해 여러 조직 또는 다른 배아 단계의 cDNA 샘플을 간단하게 서열할 수 있다. 이 간단한 방법은 실제로 서열화된 cDNA임에도 불구하고 RNA 염기서열 결정 또는 RNA-seq(“RNA-seek”라고 발음함)라고 불린다. RNA-seq에서 mRNA(또는 다른 RNA) 샘플을 분리하고, 더 짧고 비슷한 크기의 조각으로 자르고, cDNA로 전환시킨다. 이 짧은 cDNA는 순서가 정해지고, 컴퓨터 프로그램은 이들을 재배열하여 해당 종의 유전체(가능한 경우)에 지도화하거나 여러 RNA의 중첩 순서에 따란 처음부터 순서를 지정한다. RNA-seq은 마이크로어레이에 비해 몇 가지 장점이 있다. 첫째, 절차는 표지된 탐침과의 혼성화를 기반으로 하지 않으며, 그래서 그것은 유전체 서열을 가지고 있는 것에 의존하지 않는다(일반적으로 사용 가능하지만). 둘째, 마이크로어레이와 달리 매우 넓은 범위의 발현 수준을 측정할 수 있다. 마이크로어레이는 매우 낮거나 매우 높은 수준을 정확하게 측정할 수 없다. 셋째, 신중한 분석은 선택적 이어맞추기된(alternatively spliced) mRNA의 상대적 수준과 같은 특정 유전자의 발현에 대한 풍부한 정보를 제공한다. DNA 염기서열 분석의 가격이 급락함에 따라 RNA-seq은 많은 응용 분야에서 더 널리 사용되고 있다. 그러나 대부분의 경우 개별 유전자의 발현은 여전히 RT-PCR에 의해 확인될 필요가 있다.

이제 과학자들은 수천 가지 유전자의 발현을 한 번에 측정할 수 있다. DNA 기술은 이러한 연구를 가능하게 한다. 자동화를 통해 대규모로 쉽게 수행할 수 있다. 유전자 상호작용을 밝히고 유전자 기능에 대한 단서를 얻는 것에 더하여, DNA 마이크로어레이 분석법과 RNA-seq은 특정 질병을 더 잘 이해하며, 새로운 진단법이나 치료법을 제시하는 데 공헌할 수도 있다. 예를 들어, 유방암 종양과 비종양 유방조직에서의 유전자 발현의 패턴을 비교함으로써 이미 이에 대한 많은 정보와 효과적인 치료 프로토콜을 얻을 수 있었다. 궁극적으로, 이러한 방법들로부터 얻어지는 정보들은 생명체를 형성하도록 하는 유전자 상호작용이 어떻게 조화를 이루는지에 대한 더 큰 안목을 우리에게 제공해 준다.

 

참고자료: 캠벨생명과학, 11판, p407